[摘要]目的：建立SYBR green 实时荧光定量PCR 检测VEGF mRNA 水平的方法，并初步应用于美容相关疾患。方法：构建内参GAPDH 质粒，倍比稀释VEGF 和GAPDH 标准品，建立PCR 标准曲线，同时绘制熔解曲线，后应用SYBR Green 实时荧光定量PCR 检测正常皮肤、烧伤瘢痕、恶性黑素瘤细胞株A2058和WM793 cDNA的VEGF mRNA 水平。结果：VEGF、GAPDH的标准曲线，符合线性要求，相关系数r均为1，熔解曲线峰值单一，产物特异度好，四组样本的SYBR green 荧光定量PCR结果提示瘢痕组织、A2058、WM793 的VEGF mRNA 水平明显高于正常皮肤。结论：本研究成功建立了VEGF mRNA 水平的SYBR green 荧光定量PCR 检测方法。
[关键词]血管内皮生长因子；瘢痕疙瘩；血管瘤；恶性黑色素瘤；SYBR green实时荧光定量PCR
[中图分类号]R826.8[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）06-1025-03
Establishment of VEGF mRNA detection by using SYBR green
real-time fluorescent quantitative PCR
LUAN Qi,SUN Jing,SUN Lin-chao,LI Chun-ying,GAO Tian-wen
(Institute of Dermatology of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi"an 710032, Shaanxi, China)
Abstract:ObjectiveTo establish a method of SYBR green real-time quantitative PCR for detecting mRNA levels of VEGF, and apply the method to cosmetic diseases preliminarily.MethodsThe recombinant plasmid of GAPDH was constructed as standard control. Standard curves of VEGF and GAPDH were established by using a series dilution of quantified plasmids and the specificity of PCR products was analysed by their melting curves. VEGF mRNA levels of normal skin, burning scar, A2058 and WM793 melanoma cell lines were measured by SYBR green real-time quantitative PCR.ResultsTwo standard curves of VEGF and GAPDH had a linear feature and their R values were both 1. In addition, the melting curve analysis showed a single peak. The results of four groups showed that the VEGF mRNA levels were higher in burning scar tissue, A2058 cells and WM793 cells than that in normal skin tissue.ConclusionThe method of detecting VEGF mRNA levels by SYBR green real-time quantitative PCR was established successfully in this study.
Key words: vascular endothelial growth factor(VEGF); keloid; hemangioma; m alignant melanoma; SYBR green real-time quantitative PCR
血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）作为一类功能多样的生长因子，主要参与新生血管和淋巴管的形成。越来越多的研究提示，VEGF不仅与诸多美容疾患的发病密切相关，而且VEGF 的表达量亦常作为判断病程预后以及选择治疗策略的重要因素之一，这些疾患主要包括血管瘤[1]、瘢痕疙瘩[2]、恶性黑色素瘤[3]等美容范畴相关疾病。因此，本研究旨在运用新型的mRNA 定量技术平台--SYBR green 实时荧光定量PCR，建立VEGF mRNA 的检测方法，并初步应用于以上相关疾病的研究中。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系和组织来源：恶性黑素瘤细胞株A2058 和WM793 由本研究所购自美国ATCC公司；烧伤瘢痕组织由西京医院烧伤外科提供。
1.1.2 试剂和主要仪器：DMEM 购自美国Gibco 公司，T4 连接酶和SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒购自Takara 公司，Trizol 和SuperScriptTM Ⅲ 反转录试剂盒购自美国Invitrogen 公司，PTC2200 荧光定量PCR 循环仪由美国MJ 公司提供。
1.1.3 载体和引物设计：pGEM-T 载体为Promega 公司产品，pIRES2-EGFP-VEGF 由西京医院超声科于铭博士惠赠；依据VEGF mRNA 序列，选取包含VEGF 所有亚型的引物序列如下[4]：上游为5"-GCACCCATGGCAGAAGG-3"，下游为5"-GGGGTACCCCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3"，产物大小105bp；内参GAPDH 引物序列为[5]：上游为5"- AGGGGTCTACATGGCAACTG -3"，下游引物为5"- CGACCACTTTGTCAAGCTCA -3"，产物大小227bp；以上引物均由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 样本总RNA的提取：Trizol 法分别提取正常皮肤、烧伤瘢痕、A2058、WM793的总RNA，紫外分光光度仪检测RNA 质量和浓度；取RNA 3μg行逆转录反应，步骤按说明书进行，所得cDNA 置-20℃ 保存。
1.2.2 标准品质粒的构建和定量：取各组cDNA 模板2μl，用内参GAPDH 上、下游引物行PCR 反应, 条件为94℃ 3min, 94℃30s、57℃30s、72℃30s、35个循环，72℃5min；将回收PCR 产物与pGEM-T 载体4℃ 连接过夜，将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，扩增后抽提质粒，命名为pGEM-GAPDH，行PCR 鉴定正确后作为内参GAPDH的标准品质粒。VEGF 的标准品质粒为pIRES2-EGFP-VEGF。
1.2.3 标准曲线的绘制：根据标准品质粒pGEM-GAPDH、pIRES2-EGFP-VEGF定量结果和片断大小，查阅《分子克隆（第三版）》第1664页，得出质粒的拷贝浓度，后将其稀释为以下五个拷贝浓度（单位：拷贝/μl），分别为pGEM-GAPDH：108，107，106，105，104 拷贝/μl，pIRES2-EGFP-VEGF为107，106，105，104，103 拷贝/μl，作为mRNA 定量的标准品，以此绘制标准曲线。
1.2.4 SYBR green 实时荧光定量PCR 检测VEGF mRNA 水平：实验分四组，分别为正常皮肤组、烧伤瘢痕组、A2058组和WM793组；反应体系为cDNA 模板1μl，上下游引物1μl，2×SYBR Premix EX Taq 10μl，水补至20μl；反应参数为95 ℃10s，57℃15s，72℃15s，荧光检测1次，共45个循环，从70 ℃至95℃，每0.4℃/s 为间隔绘制熔解曲线，反应结束后根据熔解曲线分析产物特异性。每组设3个复孔，即n＝3。
1.2.5 统计学分析：数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，形式均采用x±s表示，数据处理应用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示有统计学差异。
2结果
2.1 GAPDH 和VEGF 的标准曲线：根据GAPDH 和VEGF 质粒DNA 定量结果，将其倍比稀释，行PCR后可见所得扩增曲线为典型的倒S形曲线，从左至右质粒DNA 浓度依次以10倍递减，且模板浓度越高，其循环阈值即Ct 越小，且五个样本基本处于一条直线，GAPDH 的相关系数r 为1，斜率为 -0.2869（图1-A），VEGF 的r 值为1，斜率为 -0.3064（图1-B），说明荧光定量PCR的质量控制较好，符合下步定量实验要求。
2.2 PCR产物特异度分析：各组样本的VEGF荧光定量PCR 前，观察熔解曲线，以熔解曲线峰值的一致性，检测产物的特异度，也是结果是否准确可信的重要参考指标。从GAPDH 和VEGF 的熔解曲线图可以看出，各样本的峰值基本一致（图2），左峰为VEGF，右峰为GAPDH，二者均未见杂峰信号出现，说明二者的PCR 参数选择适当，产物特异度较好，非特异产物对结果影响较小，为下步定量打下基础。
2.3 各组样本VEGF 的mRNA 水平检测结果：将各组cDNA 样本行VEGF 的荧光定量PCR，反应结束后，根据软件Opticon Monitor 3.0 所产生的各反应孔目的基因拷贝数，将各组结果整理分析后，如表1，结果显示VEGF的表达水平在103的数量级，GAPDH在107数量级，二者比值即为VEGF mRNA 在各组样本中的相对表达水平。
将各组VEGF 的mRNA 水平经过GAPDH 标准化后进行比较，结果提示（图3），烧伤瘢痕、恶性黑素瘤细胞株A2058、WM793 的VEGF mRNA 水平均高于正常皮肤，烧伤瘢痕可高达2.4倍，A2058、WM293 分别可高达13.6倍和5.3倍，以上结果与以往研究一致，而肿瘤细胞系的VEGF mRNA 则明显高于烧伤瘢痕组织。
* P＜0.05 vs 正常皮肤组
图3 VEGF mRNA 的SYBR 荧光定量PCR 结果
3讨论
VEGF 是血小板源性生长因子家族成员，可由多种细胞分泌，如内皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞等。VEGF 与其受体结合后可产生多种生物学效应：提高血管通透性，促进内皮细胞增殖和血管生成，改变细胞外基质，参与免疫系统调节等。VEGF 的诸多生物学功能决定了该因子重要的生理、病理作用，本研究所讨论的是VEGF 在美容相关疾患中所扮演的角色。首先，血管瘤作为婴幼儿期最常见的肿瘤之一，其发生、发展与VEGF 的关系密切，有学者发现VEGF 和雌激素可协同促进血管瘤内皮细胞的增殖[1]。瘢痕疙瘩具有侵袭性生长和术后易复发的特点，一直是困扰美容学界的难题，研究表明，瘢痕疙瘩的产生是由分泌的VEGF 促内皮细胞增殖、迁移所诱发，有研究就发现外源性VEGF 可通过生长因子受体促进瘢痕成纤维细胞的增殖[2]。而在恶性黑素瘤，VEGF既能促进内皮细胞的增殖，又能促进血管渗漏，在恶性肿瘤的生长、转移中有着重要作用。当然，VEGF 相关的美容疾患绝不仅仅以上几种，它丰富的生物学效应决定了VEGF 在多种美容疾病的重要作用，因此，建立一种准确、简便的VEGF 表达水平检测方法就显得尤为重要。
本研究所采用的新型mRNA 检测手段--SYBR green 实时荧光定量PCR技术，属于近年来新兴的在基因水平上检测目的基因表达的理想方法，正越来越多的应用到各项研究中[6]。实时荧光定量PCR 不仅可用于检测低丰度mRNA，而且还可以借助标准品质粒达到定量的目的。该方法与常规RT-PCR 方法相比，其优点主要在于：在PCR 反应的对数期检测其Ct 值，优于积累PCR 产物量进行终点检测，使定量更准确、重复性更好；无需PCR 后处理，反应全程闭管操作大大降低了交叉污染的危险性。而在目前的荧光定量PCR 中，较为简单、经济、有效的方法便是通过嵌入双链DNA 的荧光染料--SYBR Green 来检测PCR 扩增产物。在PCR 的延伸阶段，SYBR Green 与双链DNA 相结合而发出荧光，随着反应的进行，荧光信号逐渐增强。荧光信号的强度依赖于反应体系中现有的双链DNA （包括特异性扩增产物和引物二聚体等）的量。因此，一旦PCR 反应体系中出现非特异扩增，就会影响到定量结果的可靠性与重复性。本研究中，我们通过熔解曲线控制反应的特异度，通过标准品质粒的拷贝数来绘制标准曲线，提高检测的重复性。从本研究所得到熔解曲线及标准曲线看，SYBR 荧光定量PCR 的质量控制较好，结果较为准确可靠。
本研究以绝对定量的GAPDH 和VEGF 标准品质粒为参照，对正常皮肤、烧伤瘢痕组织、恶性黑素瘤细胞株A2058、WM793 的VEGF mRNA 的表达水平进行了SYBR green 荧光定量PCR 检测，建立了一种切实可行、客观可信的VEGF mRNA 表达水平的检测方法。
[参考文献]
[1]Xiao X, Liu J, Sheng M. Synergistic effect of estrogen and VEGF on the proliferation of hemangioma vascular endothelial cells[J]. J Pediatr Surg, 2004, 39(7):1107-1110.
[2]Wu WS, Wang FS, Yang KD, et al. Dexamethasone induction of keloid regression through effective suppression of VEGF expression and keloid fibroblast proliferation[J]. J Invest Dermatol, 2006, 126(6):1264-1271.
[3]Rivera RS, Nagatsuka H, Siar CH, et al. Heparanase and vascular endothelial growth factor expression in the progression of oral mucosal melanoma[J]. Oncol Rep, 2008, 19(3):657-661.
[4]Takenaka K, Katakura H, Chen F, et al. The ratio of membrane-bound form Flt-1 mRNA to VEGF mRNA correlates with tumor angiogenesis and prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Lett, 2007, 246(1-2):34-40.
[5]Kato M, McDonald KJ, Khan S, et al. Expression of human DEC-205 (CD205) multilectin receptor on leukocytes[J]. Int Immunol, 2006, 18(6):857-869.
[6]Draganov P, Todorov S, Todorov I, et al. Identification of HPV DNA in patients with juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis using SYBR Green real-time PCR[J]. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2006, 70(3):469-473.
[收稿日期]2008-03-29 [修回日期]2008-05-16
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”