[摘要]目的：了解体外培养的人脂肪问充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力。方法：体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数，行成骨和成脂诱导，流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子。结果：人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CDl06，而CD49d、CD34、CD45和HLA―DR表达阴性。细胞周期分析表明：G0／G1、s和G2／M所占比例分别为79．1％、19．7％和1．3％。分离细胞在诱导体系下可以向成骨和戍脂方向分化。结论：脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点，体外能够向成骨和成脂方向分化。
[关键词]脂肪间充质干细胞；分化；脂肪细胞；成骨细胞
[中图分类号]Q813．1 [文献标识码]A [文章编号]1008―64 55(2007)02―0159－03
间充质干细胞最初由Friedensrein等Ⅲ发现，其广泛分布于肌肉、血管、胰腺和脂肪等组织中，而且证实在体外可以分化为成骨细胞和成脂细胞。其中脂肪来源的间充质干细胞取材方便，痛苦小，在细胞治疗和组织工程方面有广阔的前景因而日益引起研究者的重视。本研究通过分离脂肪组织的间充质干细胞，研究其生物学特性及体外成脂及成骨的能力，为其作为组织工程的种子细胞提供理论依据。
1材料和方法
1．1材料与试剂
1．1．1细胞培养体系：MEM培养基(GIBC0)，10％胎牛血清(兰州明海生物公司)，100IU／L青、链霉素。
1．1．2细胞表面分子鉴定相关试剂：CD44、CD49d、CD34、CD45、CDl06和HLA-DR(鼠抗人cALTAG)FITC(羊抗鼠ZYMED)
1．1．3细胞周期测定相关试剂：R Nase A(TakaRa)、碘化丙啶(PI，Sigma)。
1．1．4其他试剂：胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸钠、维生素C、胰岛素、卜甲基3－异丁基一黄嘌呤、吲哚美辛、胶原酶I(sigma)。
1．2方法
1．2．1脂肪间充质干细胞的分离纯化与培养：脂肪组织来源于兰州军区兰州总医院美容中心行脂肪抽吸术的患者，身体健康，无任何疾病。无菌条件下，在局部肿胀麻醉下采用注射器法抽取50ml颗粒脂肪组织，静置30min，去除上清液体，获得纯度较高的脂肪颗粒，用等容的D―Hank’s平衡盐液清洗4次，去除细胞碎片。然后用150ml HBSS(含0．075％胶原酶I)，在37℃，振动消化lh。胶原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后离心1200r，lOmin。细胞被悬浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目筛网过滤。离心后，细胞重悬于MEM培养液，添加至培养皿，37℃，C02孵箱中培养24h，未贴壁的细胞和残渣被除掉，添加新鲜培养液于贴壁细胞。细胞培养至80％融合时，用胰酶／EDTA消化和按1：1的比例传代。
1．2．2细胞形态学观察：细胞接种后每次换液时用相差显微镜观测细胞生长与形态变化，并分别于细胞接种后24h、10天、2周时摄相记录。在培养皿里加入盖玻片，待细胞爬满后经过PBS清洗后，固定行油红0染色。
1．2．3细胞表面分子测定：取传第二代以后的细胞用于以下实验，操作步骤如下：
培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min，5min)后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为l×108／L，分别于人抗CD34、CD44、CD45、CEl06、CD49d和HLA-DR单克隆抗体室温反应30min，PBS洗涤2次后于FITC标记的二抗避光作用30min。用PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。
1．2．4细胞周期的测定：培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000 r／min，5min)，调整细胞浓度至1×108／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNase A处理30min，PI染色lOmin。用Cellquest软件获取10000个细胞，ModiFit分析细胞周期。
1．2．5细胞的油红0染色：先将培养皿中的培养液倒掉，并用PBS洗1～2遍，然后加入10％福尔马林固定30min以上，倒固定液，用60％异丙醇浸泡30min，换油红O染液1h，倒染液，60％异丙醇涮洗1次(5s)，自来水冲洗2～3min，换福尔马林观察并照相保存。
1．2．6脂肪间充质干细胞的成骨诱导：取传2代细胞，以l×108／cm2的浓度接种与2个6孔板中。当细胞贴壁生长达80％汇合时，每孔加入等量的成骨诱导试剂：含地塞米松(10-7mol／L)、B一甘油磷酸钠(10mmol／L)、维生素C(50mg/L)，放入C02孵箱培养，2～3天换液。分别于细胞培养1、2周时吸出每组培养液，PBS洗2次，消化并离心，用MEM重悬细胞，然后离心涂片，行ALP染色。
1．2．7脂肪间充质干细胞的成脂诱导：取传2代细胞，以l×108／cm2的浓度接种与2个6孔板中。当细胞贴壁生长达80％汇合时，每孔加入等量的成脂诱导试剂：含lmol／L地塞米松、lOtxg／ml胰岛素，0．5mmol／L 1一甲基3一异丁基一黄嘌呤，1001xmol／1吲哚美辛。对照组加常规培养液。每3～4天换液。3周后行油红O染色。
2结果
2．1倒置相差显微镜观察：接种后24h，极少数细胞贴壁，呈梭形，4天后细胞呈纤维集落样生长，大约10天，细胞迅速生长并形成克隆，2周左右细胞近80％～90％汇合，出现致密的贴壁层。继续培养，可见有自发分化的现象出现不典型的聚集的小脂泡。油红0染色证实为脂肪，见图l。分别为接种后24h，4天，2周，自发成脂分化的细胞。
2．2脂肪问充质干细胞表面抗原分子测定：流式细胞仪检测结果显示：脂肪间充质干细胞均．的表达CD44,CDl06阳性，而CD34,CD45、CD49d和HLA―DR呈阴性表达。CD49d和CDl06是脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的很好的区分标记，见图2。
2．3脂肪问充质干细胞的细胞增殖周期：取3代细胞经过流式细胞仪分析表明：G0。／G1、s、G2／M的细胞所占的比例为79．1％、19．7％、1．3％。结果显示：我们分离培养的细胞处于G0／G1期，仅少数细胞处于活跃的增殖期，
2．4细胞ALP染色：第3代细胞在体外进行成骨诱导时ALP阳性率较未诱导组明显提高，见图3。说明干细胞在成骨诱导体系下向成骨细胞分化。 2．5细胞的油红0染色：第3代细胞在体外进行成脂诱导时阳性率较未诱导组明显提高，见图4。说明脂肪间充质干细胞在成脂诱导体系下向脂肪细胞分化。
3讨论
近年来骨髓间充质干细胞是研究的热点，考虑到脂肪组织和骨髓同为中胚层起源的组织，是否具有多向分化潜能，在实验中我们使用从脂肪抽吸术中获取的脂肪颗粒，而没有像其他文献中使用腹部或取深层脂肪，其方法简单，减轻供者的痛苦，并且肿胀麻醉使用的利多卡因和肾上腺素经过洗涤可除去，不会对其生物学特性产生影响。在现有的实验方法中，为排除红细胞的干扰，常使用NH4CL破坏红细胞。鉴于红细胞不贴壁的特性，我们通过换液的方法去除红细胞，取得很好的效果，2次换液后，红细胞基本消失，而且减轻了NH4CL对脂肪干细胞的损伤。
众所周知，骨髓问充质干细胞无特异的表面标志，而De Ugarte等在一个病人身上分别取骨髓和脂肪组织，并对二者进行了比较，初步证明在生长方式、多向分化潜能和细胞表面标记无显著的差异。本研究测定CD34、CD45、CD49d和HLA-DR阴性，CD44、CDl06阳性。CD49d和CDl06是脂肪问充质干细胞和骨髓间充质干细胞的很好的区分标记。HLA-DR是成纤维细胞的表面标记，CD34、CD45是造血干细胞的表面标记，通过它们我们可以认为培养细胞为排除了成纤维细胞的干细胞，HLA-DR阴性也可以为脂肪问充质干细胞的自体或同种异体移植提供理论依据。
细胞周期检测显示贴壁细胞中的G0／G1、S、G2／M的细胞所占的比例为79．1％、19．7％和1．3％。说明绝大部分细胞处于静止态，但保留自我更新和增殖能力，少部分处于功能态，这符合干细胞的特性，该结果也支持培养的贴壁细胞为问充质干细胞。本研究分别使用了诱导剂使其向成骨和成脂方向分化。地塞米松作为两者的诱导剂，它依赖于使用剂量和作用时间的差异，在低浓度时表达为成骨细胞，而高浓度时则与胰岛素共同作用激活糖皮质激素受体，继而启动PPARr，在转录水平激活脂肪细胞基因使其分化为脂肪细胞。由此推测成骨和成脂之间是否有某种关联，值得进一步研究。另外本研究还发现在无血清和低血清的条件下，诱导明显好于10％胎牛血清，但增殖速度明显减慢。
脂肪间充质干细胞与其它干细胞相比，具有显著的优越性，它容易获取，对患者的痛苦小，并且在脂肪抽吸术中获取脂肪还可以达到变废为宝的目的。其次这种细胞在体外增殖快，平均倍增时间为16h，不必进行永生化就能获取足够的细胞进行移植。人来源的脂肪间充质干细胞能够进行自体移植，可以克服免疫排斥。因此有望成为脂肪组织工程和基因治疗的一种很好的细胞来源。
编辑／张惠娟
(注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。)