[摘要]目的：探讨干扰素（IFN）对体外培养的腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞生物学作用的影响。方法：制作兔腭裂术后裸露骨面瘢痕动物模型,利用体外细胞培养技术，通过MTT法、流式细胞术等方法观察、分析rhIFNα-2b和rhIFN-γ对腭裂术后瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响，数据采用方差分析及q检验处理。结果：与对照组比较，实验组加入干扰素后，腭裂术后瘢痕成纤维细胞的生长趋势及增殖活性及被明显抑制，S-G2-M期细胞百分数明显降低。结论：干扰素对腭裂术后瘢痕成纤维细胞的生长趋势及增殖活性具有明显抑制作用，说明在防治腭裂术后裸露骨面瘢痕的形成中有一定的应用价值。
[关键词]腭裂；瘢痕；成纤维细胞；rhIFNα-2b；rhIFN-γ
[中图分类号]R619+.6R782.2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）06-0926-03
Empirical study of interferon affecting on the fibroblasts of the exposed bone surface from cleft palate scar
TAO Ming1,2,HU Chao3,DING Ding1,ZHAO Li-li1,ZHAN Jia1,SUN Hui1,SUN Hui1,WANG Yuan-yin1,ZHOU Jian1
(1.Stomatological Hospital,Anhui Medical University,Hefei 230032,Anhui,China;2.Department of Stomatology,Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 24100,Anhui,China;3.Department of Stomatology,The Third Military Medical University,Chongqing 400037)
Abstract:ObjectiveTo study the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface from cleft palate scar in vitro cultural. MethodsMaking rabbit cleft palate scar models, in vitro culture,observed by MTT assay and flow cytometry, analysis the effects of interferon to the biological activities of fibroblasts origined from the exposed bone surface of cleft palate scar. Data using analysis of variance and q test treatment. ResultsCompared with the control group,after added interferon, cleft palate fibroblast"s growth trends and value-added activity of experimental group was inhibited significantly. Percentage of cells decreased during the S-G2-M stage.ConclusionsInterferon on the growth trends and value-added activity of the cleft palate fibroblast has significant inhibitory effect, indicating that cleft palate in the prevention of scar formation of the exposed bone surface has some value.
Key words:cleft palate；scar；fibroblast；rhIFNα-2b;rhIFN-r
先天性腭裂发病率约占人口出生率的1/700左右，严重影响患者的口腔颌面部器官的形态与功能及心理健康。虽然目前的外科技术已能实现对腭部裂隙的良好修复，有助于语音及吞咽功能的恢复，但大量的临床与基础研究证实，术后患者上颌骨的生长发育继发畸形会变得更为严重，对患者的颌面形态与功能构成严重危害。腭裂术后上颌骨继发生长畸形的病理解剖学基础已经探明是腭裂术后遗留在上颌骨硬腭的裸露骨面瘢痕挛缩所致[1-2]。因此，如何防治腭裂术后裸露骨面瘢痕形成是目前口腔颌面外科领域亟待解决的难题之一。在瘢痕的形成与增生过程中，成纤维细胞是主要的效应细胞，其功能状态是影响瘢痕发生、发展、以及转归的主要因素。干扰素（IFN）具有抗病毒、抗肿瘤、影响细胞增殖分化等多种生物学效应。临床上已经有将干扰素用于防治瘢痕形成的报道,但用干扰素观察腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响尚未见报道，本实验通过体外观察和研究干扰素对腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞的生物学作用，可为寻求应用干扰素治疗腭裂术后裸露骨面瘢痕提供实验依据。
1材料和方法
1.1 实验试剂：DMEM培养基（低糖 美国Sigma公司），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），PBS(pH7.2～7.4)液，Hank"s(pH7.2～7.4)液（自配），rhIFNα-2b和rhIFN-γ（安徽安科生物工程股份有限公司），MTT溶液（5mg/ml）(美国Amresco公司)，二甲亚砜（DMSO，分析纯）。
1.2 实验方法
1.2.1兔腭裂术后裸露骨面瘢痕动物模型的制备：成年大耳白兔6只（合肥工业大学控释药物研究中心动物室提供），体重2千克，3%戊巴比妥钠溶液按30mg/kg进行耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定四肢，张口，沿腭中缝做纵行切口，逐层切开腭部软组织，骨膜分离器左右分离软组织，显露出上腭裸露骨面，彻底止血后沿切口缝合。麻醉效应过后，兔肢体可自由活动，术后连续5天每日肌注80万单位青霉素，术后4周在全麻下沿原切口切开，取腭部裸露骨面上的瘢痕组织以进行下一步实验。
1.2.2腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞的原代培养及传代：采用组织块法进行成纤维细胞原代培养(见照片2)，用含15%新生小牛血清DMEM培养液于37℃、5%CO2孵箱中培养，2～4天更换培养液，待原代培养长出的成纤维细胞接近或达到融合时，用0.25%胰酶消化传代。
1.2.3细胞生长增殖情况（MTT测定法）：取第3～5代生长状态良好的对数生长期细胞，消化后用15%新生小牛血清DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞数位1×106/ml，接种于96孔培养板中，共2板，每孔加入200μl，并留下不含细胞和培养液的调零孔，将96孔板移入37℃、5%CO2孵箱中培养24h。取出96孔板，弃上清液，每孔加入200μl无血清DMEM培养液继续培养24h。取出96孔板，换新培养液，实验1组分别加入浓度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培养液，实验2组分别加入浓度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培养液每孔液体总量为200μl；对照组加相同容积的DMEM培养液；每一浓度药物设6个平行孔。将96孔板置入37℃、5%CO2孵箱中分别培养24、48h。
MTT测定法：取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，继续培养4h后取出，小心吸去孔内上清液，每孔加入150μlDMSO,振荡10min，使结晶物充分溶解；选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收（OD）值。
1.2.4细胞周期分析(流式细胞术)：取第6～8代生长状态良好的对数生长期细胞，消化后制成单细胞悬液，调整细胞数为1×106/ml，接种于25cm2的细胞培养瓶内，培养24h。弃原培养液，加入无血清DMEM培养液继续培养24h，进行细胞同步化处理。实验1组分别加入终浓度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培养液；实验2组分别加入终浓度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培养液；对照组加入相同容积的DMEM培养液，每组3瓶。将培养液置入37℃、5%CO2孵箱中培养48h；0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，1 000r/min离心5min，弃上清，收集细胞，70%冰乙醇固定18h，4℃保存；PI综合染液室温下避光染色30min，300目尼龙网膜过滤，流式细胞仪测细胞周期。
1.3统计学处理：实验结果用x±s表示，采用方差分析及q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 干扰素抑制腭裂术后瘢痕成纤维细胞生长增殖：MTT比色实验测定结果显示，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ培养24h后实验组于对照组OD值之间差异无统计学意义（P＞0.05），培养48h后，与对照组比较，2 000U/ml浓度组差异无统计学意义（P＞0.05），4 000、6 000、8 000、10 000U/ml浓度组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），提示rhIFNα-2b和rhIFN-γ对腭裂术后裸露骨面成纤维细胞的增殖有抑制作用（见表1、表2）。
2.2干扰素对腭裂术后瘢痕成纤维细胞的细胞周期的影响：流式细胞术测定结果显示：对照组成纤维细胞培养48h处于S-G2-M期的百分比为（44.54±3.21）%，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ作用48h，与对照组比较，2 000U/ml浓度组差异无统计学意义（P＞0.05）；而4 000、6 000、8 000、10 000U/ml浓度组处于S-G2-M期的百分比均明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（见表3）。
3讨论
国内外研究已表明，腭裂术后硬腭部裸露骨面的形成及瘢痕修复将抑制患者上颌骨的生长，引起患者颜面部凹陷，反牙合等畸形和功能障碍。有研究表明裸露骨面的瘢痕组织，由于缺少大血管和弹力纤维，胶原纤维呈横向走行并通过沙比纤维附着于硬腭骨上，而且粘骨膜与牙周韧带相延续，因此在收缩时，对牙弓产生向内的牵张力，从而导致了面中份骨的发育不足[3]。创伤愈合是人体组织修复的一种过程，而瘢痕形成则是过度愈合或愈合紊乱。瘢痕中的成纤维细胞是创面愈合、瘢痕形成、增生和挛缩的功能性细胞，其增殖、活化、分化的异常直接导致病理性瘢痕的形成。干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等多种生物活性的细胞因子。它是目前比较明确的瘢痕增生负性调节因子[4-5]。近年来,许多体外研究表明干扰素具有抑制成胶原的合成，促进胶原降解以及激活胶原酶的活性,起到对病理性瘢痕中成纤维细胞的抑制作用[5-6]。临床上也有局部注射干扰素来治疗病理性瘢痕的报道[7-8]。然而，干扰素是否对腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞有抑制作用，之前未见报道。本实验将干扰素作用于体外培养的兔腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞中，结果表明对细胞增殖产生明显的抑制作用。
我们为了能够将干扰素应用到预防腭裂术后的继发畸形中，于是在此首先观察了rhIFNα-2b和rhIFN-γ对体外培养的腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞的作用，以便为后续研究打下基础。本实验显示，IFN在较高浓度时对瘢痕成纤维细胞的生长增殖具有明显的抑制作用。本实验中采用MTT法检测IFN对成纤维细胞生长增殖的影响，结果发现当加入IFN48h后，4 000～10 000U/ml浓度组OD值明显低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），说明实验组的细胞比对照组细胞生长要慢，活细胞数相对较少，提示IFN对细胞增殖活性产生了抑制作用。但实验组细胞48h的OD值与24h相比仍然有所增加，说明rhIFNα-2b不能绝对抑制细胞增殖，而是抑制了细胞的增长趋势。由于MTT比色法测定反映的是细胞总数，于是我们又应用流式细胞仪测定了细胞总数中各细胞周期的百分比，反映细胞中处于分裂期的总体比例，能准确地揭示群体细胞中具有分裂能力的细胞量。结果显示加入IFN后在短时间内（24 h）与对照组无明显差别，而延长观察时间（48h） 则整体瘢痕成纤维细胞中处于S-G2-M期的比例降低（2 000 U/ml浓度组除外）。说明加入的IFN的抑制活性与细胞数量改变之间有一定的时间浓度依赖关系。我们预测：高浓度的IFN在促使瘢痕组织软化、预防和治疗瘢痕挛缩方面可以发挥作用。
本研究分析测定了IFN对瘢痕成纤维细胞的生物学效应。体外实验肯定了IFN对腭裂术后裸露骨面瘢痕的成纤维细胞的生长趋势及增殖具有显著的抑制作用。虽然其具体的作用机制目前尚未完全清楚，但为进一步进行活体实验提供了依据，也为临床上预防和治疗腭裂术后裸露骨面瘢痕形成及术后上颌骨继发畸形提供了重要的参考信息。
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[收稿日期]2011-03-18 [修回日期]2011-05-14
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”