刺甘草查尔酮诱导 AKT/mTOR 依赖的自噬和凋亡而抑制食管癌肿瘤的生长和侵袭
导读
食管鳞状细胞癌 (ESCC) 是最常见的恶性肿瘤之一，生存率较低。因此，临床治疗迫切需要寻找稳定、安全、高效的新药物。
本研究旨在从一个包含 9 429 种天然产物的化合物文库中识别出潜在的抗癌药物。从甘草中分离得到的 刺甘草查尔酮对 C ESCC 具有明显的细胞凋亡、抑制增殖和转移的能力。共聚焦荧光显微镜数据显示， 刺甘草查尔酮显著诱导 C ESCC 细胞自噬，自噬抑制剂巴弗洛霉素
1 A1 减弱了刺甘草查尔酮对细胞活力和凋亡的抑制作用。机制上，RNA 测序结合生物信息学和一系列功能分析显示， 刺甘草查尔酮通过失活 R AKT/mTOR 信号通路而诱导细胞凋亡和自噬，然而 AKT 的结构性激活则显著抑制了这一作用。此外，研究证明了 刺甘草查尔酮在异种移植瘤模型中具有显著的抗肿瘤作用，并以剂量依赖的方式显著抑制 C ESCC 细胞的迁移和侵袭能力。本研究的发现首次证明刺甘草查尔酮可能是治疗 ESCC 的一个新的治疗策略。
实验设计
结果
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刺甘草查尔酮可诱导 C ESCC 细胞凋亡，降低细胞增殖
本研究之前已从含 429 种化合物的天然药物库中鉴定出有效的抗癌药物。本研究中， 从甘草属植物( ( 豆科) ) 的根和根茎中提取的甘草活性成分刺甘草查尔酮( (图 图 1a) ，被鉴定为 C ESCC 细胞增殖的候选抑制剂。为了评价刺甘草查尔酮对 ESCC 细胞增殖的影响，本研究 用浓度递增的刺甘草查尔酮处理 0 KYSE30 和 和 0 KYSE270 细胞，持续 5 5 天。如图 1b 所示， 刺甘草查尔酮以剂量和时间依赖的方式显著抑制细胞增殖。克隆形成实验表明，刺甘草查尔酮显著降低了克隆形成的能力(图 1c)。综上所述， 刺甘草查尔酮在 C ESCC 中可能具有抑癌活性。为观察刺甘草查尔酮对 ESCC细胞凋亡的影响，用之前浓度的刺甘草查尔酮处理 ESCC 细胞，结果显示， 刺甘草查尔酮以剂量依赖性的方式诱导 C ESCC 细胞凋亡(图 1d 和 S1A)，表明 刺甘草查尔酮可诱导 C ESCC 细胞凋亡。经刺甘草查尔酮处理后，凋亡标志物表达增加，包括 cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP(图1e 和 S1B)，进一步证实刺甘草查尔酮对细胞凋亡的诱导作用。总之，这些结果表明 刺甘草查尔酮可触发 C ESCC 细胞凋亡，抑制细胞增殖。
图 1. 刺甘草查尔酮抑制 ESCC 细胞增殖。a 刺甘草查尔酮的化学结构。b 用不同浓度的刺甘草查尔酮处理 KYSE30 和 KYSE270 细胞(浓度不超过 40 μM)，CCK-8 法测定细胞活力。c 暴露于刺甘草查尔酮后，KYSE30和 KYSE270 细胞的克隆形成受到抑制。d 不同浓度刺甘草查尔酮作用 48 h 后，Annexin V-FITC/PI 双染色法检测 ESCC 细胞凋亡。Western blot 检测刺甘草查尔酮处理 48 h 后 ESCC 细胞中 cleaved caspase-3、caspase-3和 cleaved PARP 的表达情况。
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刺甘草查尔酮诱导 C ESCC 细胞自噬
接下来研究人员 研究了刺甘草查尔酮是否能诱导 C ESCC 细胞自噬。共聚焦分析显示，将KYSE30 和 KYSE270 细胞暴露于刺甘草查尔酮中可导致 LC3 点状细胞积累(图 2a, b)。此外，western blot 结果证实刺甘草查尔酮处理的细胞中 LC3 的表达呈剂量依赖性增加(图 2c)。此外，如图 2d, e 所示，自噬抑制剂 bafilomycinA1 (BafA1)预处理可以恢复刺甘草查尔酮处理的 KYSE30 和 KYSE270 的细胞活力和克隆形成能力。在 BafA1 处理下，刺甘草查尔酮诱导的细胞凋亡被逆转(图 2f)，而在 BafA1 阻断自噬后，刺甘草查尔酮诱导的 cleaved-caspase-3 和cleaved-PARP 的表达也显著下降(图 2g)。说明 刺甘草查尔酮诱导 C ESCC 细胞凋亡可能是通过激活自噬来实现的。
图 2.刺甘草查尔酮诱导 ESCC 细胞自噬。用免疫荧光法(a)和 Western blot 法(c)比较经刺甘草查尔酮处理的 KYSE30 和KYSE270 细胞 LC3 的表达情况，b 荧光显微镜下计算每个细胞 LC3 的点数和有 LC3 点的细胞百分率。用不同浓度的刺甘草查尔酮处理 KYSE30 和 KYSE270 细胞，加入或不加入 BafA1 (0.5 nM, 12 h)预处理，然后分别用 CCK-8 法(d)和克隆形成法(e)测定细胞的存活率和克隆形成能力。采用 Annexin V-FITC/PI 双染色(f)和 western blot (g)对不同浓度刺甘草查尔酮加或不加 BafA1 预处理(0.5 nM, 12 h)对 ESCC 细胞凋亡及凋亡标志物表达情况。
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R AKT/mTOR 信号通路介导刺甘草查尔酮对 C ESCC 细胞自噬和凋亡的作用
为探讨刺甘草查尔酮诱导 C ESCC 细胞凋亡和自噬的分子机制，采用 RNA- -q seq 分析 20 μM M 刺甘草查尔酮处理 8 48 小时后 0 KYSE30 细胞中差异表达的基因。共鉴定出 688 个基因被刺甘草查尔酮显著调控(fold change≥4)，包括上调 105 个，下调 583 个(补充表 S1)。然后使用 IPA分析描述典型通路。图 3a 所示， 刺甘草查尔酮调控的一簇基因构成了一个强烈指向 T AKT 通路的信号网络。经验证，研究人员发现刺甘草查尔酮可以显著降低 p-AKT 和 p-mTOR 的表达水平(图 3b)，这表明 刺甘草查尔酮可以抑制 T mTOR/AKT 通路，而 T mTOR/AKT 通路在不同类型的癌症中可以抑制自噬。为了研究刺甘草查尔酮是否通过 AKT/mTOR 途径诱导细胞自噬和凋亡，研究人员将 AKT 的组成活性形式 AKT (T308D/S473D)的载体转染到 KYSE30 和 KYSE270 细胞中，检测刺甘草查尔酮的抗癌作用(图 3c)。结果显示 AKT (T308D/S473D) 的表达显著提高了经刺甘草查尔酮处理的 0 KYSE30 和 和 KYSE0 270 细胞的活力(图 3d)。此外，AKT (T308D/S473D)过表达抑制了刺甘草查尔酮诱导的细胞凋亡(图 3e)， western blot 进一步证实，AKT (T308D/S473D)过表达时，刺甘草查尔酮诱导的 cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP 的表达明显减少(图3f)。此外，AKT (T308D/S473D)过表达也能逆转刺甘草查尔酮处理后 LC3 蛋白表达升高的趋势(图 3f)。本研究结果表明， 刺甘草查尔酮通过抑制 R AKT/mTOR 通路诱导 C ESCC 细胞自噬性凋亡。
图 3. AKT/mTOR 信号通路介导刺甘草查尔酮对 ESCC 细胞自噬和凋亡的作用。a IPA 通路分析提示刺甘草查尔酮处理的 KYSE30 细胞中 AKT 通路失调。b 将 KYSE30 和 KYSE270 细胞暴露于不同浓度的刺甘草查尔酮作用 48 h，采用 western blot 检测 AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 的表达水平。c-f KYSE30 和 KYSE270 细胞转染 AKT(T308D/S473D)表达质粒或空载，不同浓度刺甘草查尔酮处理 48 h,然后相比 p-mTOR 表达(c),细胞生存能力(d),细胞凋亡(e)和 AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR, LC3, cleaved caspase-3 和 cleaved PARP 的表达水平(f)。
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刺甘草查尔酮增强 C ESCC 细胞对 5 5- -U FU 的敏感性
ESCC 的不良预后与化疗耐药有关。为了研究刺甘草查尔酮在肿瘤化疗耐药性中的生物学作用，研究通过 CCK-8、克隆形成和 western blot 检测了有无刺甘草查尔酮的 ESCC 细胞对 5-FU的敏感性。与低剂量刺甘草查尔酮或 5-FU 单独使用相比，低剂量刺甘草查尔酮和低剂量 5-FU联合显著抑制细胞生长(图 4a)和集落形成(图 4b)。刺抑素和 5-FU 联合处理 ESCC 细胞后，cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP 表达增加(图 4c)。总的来说，这些数据表明刺甘草查尔酮可以通过诱导 ESCC 细胞凋亡而增加细胞对 5-FU 的敏感性。
图 4. 刺甘草查尔酮增强 ESCC 细胞对 5-FU 的敏感性。a, b 采用 CCK-8 法(a)和克隆形成试验(b)检测 KYSE30和 KYSE270 细胞在 5-FU(1.25 或 0.3 μM)、刺甘草查尔酮(20 μM)单独作用或 5-FU 与刺甘草查尔酮联合作用5 d 后的细胞活力和克隆形成能力。c 刺甘草查尔酮增加了 5-Fu 处理的 ESCC 细胞的凋亡，这表明 cleaved caspase-3 和 cleaved PARP 的表达水平升高。
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刺甘草查尔酮抑制 C ESCC 细胞的迁移和侵袭
接下来 研究人员分析了刺甘草查尔酮对 C ESCC 细胞迁移和侵袭特性的影响，结果显示， 刺甘草查尔酮显著抑制了 0 KYSE30 和 和 0 KYSE270 细胞的迁移和侵袭能力(图 5a, b)。western blot检测 EMT 标志物 vimentin、β-catenin 和 E-cadherin 的表达。E-cadherin 表达升高，vimentin和β-catenin 表达降低，表明 刺甘草查尔酮通过逆转 T EMT 抑制 C ESCC 细胞的迁移和侵袭。为了研究刺甘草查尔酮是否通过 AKT 途径抑制迁移和侵袭，将 AKT (T308D/S473D)质粒转染 KYSE30和 KYSE270 细胞，结果表明，T AKT 信号通路的激活可明显消除刺甘草查尔 酮对 C ESCC 细胞迁移和侵袭的抑制作用(图 5d, e)。
图 5. 刺甘草查尔酮抑制 ESCC 细胞的迁移和侵袭。通过细胞迁移和侵袭实验测定不同浓度刺甘草查尔酮作用KYSE30 和 KYSE270 细胞 24 h 后的迁移能力(a)和侵袭能力(b)。c Western blot 分析刺甘草查尔酮作用于 KYSE30和 KYSE270 细胞 24 h 后 vimentin、β-catenin 和 E-cadherin 的表达，将转染 AKT (T308D/S473D)表达质粒或载体对照的 KYSE30 和 KYSE270 细胞以指定浓度的刺甘草查尔酮处理 24 h，比较其迁移能力(d)、侵袭能力(e)。
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刺甘草查尔酮抑制裸鼠 C ESCC 肿瘤异种移植瘤的生长
分别用 g 20 mg/kg 和 和 g 50 mg/kg 的刺甘草查尔酮口服 0 KYSE270 来源的肿瘤异种移植瘤裸鼠，观察其对肿瘤生长的影响。结果发现， 接受 g 20 mg/kg 和 和 g 50 mg/kg 刺甘草查尔酮治疗组的肿瘤负荷分别显著抑制 57%和 和 48%(图 6a)。Western blot 数据显示， 刺甘草查尔酮抑制 AKT/mTOR通路，表现为 p p- -T AKT 和 和 p p- -R mTOR 表达水平降低(图 6b)。在体重方面，治疗组和对照组之间没有显著差异(图 6c)。此外，刺甘草查尔酮治疗对肺、肝、肾等重要器官的形态没有明显改变(图6d)。此外，裸鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平无显著差异(图 6e)，表明 刺甘草查尔酮对动物无毒性作用。
图 6. 刺甘草查尔酮抑制裸鼠 ESCC 肿瘤异种移植瘤的生长。采用口服刺甘草查尔酮(20mg/kg 或 50mg/kg)治疗KYSE270 来源异种肿瘤裸鼠，每 2 天给药一次(n=6/组)，对照组只给生理盐水。a 肿瘤曲线显示刺甘草查尔酮能明显抑制异种肿瘤的生长。b Western blot 检测刺甘草查尔酮或空白处理小鼠肿瘤组织中 AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 和 LC3 的表达水平。c 实验期间裸鼠体重。d 苏木精和伊红(H&E)染色治疗组和对照组小鼠肺、肝、肾标本。e 刺甘草查尔酮治疗组与对照组血清 ALT、AST 水平比较。
结论
综上所述， 刺甘草查尔酮是一种潜在的抗癌天然产物，对 C ESCC 的肿瘤发生和转移具有抑制作用，并能使 C ESCC 细胞对 5 5- -U FU 治疗敏感。从机制上讲， 刺甘草查尔酮通过 R AKT/mTOR 信号通路诱导细胞自噬和凋亡(图 7)。这是 首次证实刺甘草查尔酮的抗癌生物活性及其机制。这些研究结果为刺甘草查尔酮作为 ESCC 治疗的潜在选择提供了坚实的证据。
图 7. 刺甘草查尔酮在癌细胞中的作用机制示意图。激活 AKT/mTOR 信号通路抑制自噬，调节 ESCC 细胞增殖与凋亡之间的平衡，而刺甘草查尔酮通过抑制 AKT/mTOR 通路诱导细胞自噬与凋亡，抑制细胞生长与肿瘤发生。