[摘要]目的：通过对制备的异种肌腱基质材料生物相容性的体外实验研究，鉴定其作为软组织修复充填材料的可行性，为进一步试验研究和临床应用提供依据。方法：参照医疗器械生物学评价标准和要求，采用标准的毒理学方法进行急性毒性试验、致敏试验、皮内刺激实验、细胞毒性试验、遗传毒性试验，对制备的异种肌腱基质材料进行评价。结果：急性毒性实验：各组小鼠活动正常，72h 小鼠无死亡，各组动物未见中毒症状或不良反应。致敏试验显示材料组和阴性对照组的皮肤反应指数均为0,无致敏性。皮内刺激实验观察显示，材料浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死，极轻微刺激。材料的细胞毒性结果示该材料的相对增殖度较高，细胞毒性分级在 0-1 级。遗传毒性试验指标均达到标准要求，无遗传毒性。结论：异种肌腱基质材料具有良好的生物相容性，满足作为软组织修复充填材料的生物安全性要求，有望成为一种理想的软组织充填材料。
[关键词]异种材料；生物相容性
[中图分类号]R318.08Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）05-0787-04
Experimental studies on biocompatibility of xenogenic tendon matrix materials in vitro
CHEN Yuan-Liang1,JIANG Ping1,XIA Xue-ying1,CHEN Wei1,ZHANG Wei2
(1.Department of Plastic Surgery,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China;2.National Engineering Laboratory for Regenerative Implantable Medical Devices,Guangzhou 510663,Guangdong,China)
Abstract:ObjectiveTo evaluate the biocompatibility of novel manufactured xenogenic tendon matrix materials and to provide basis for further experimental study and clinical application.MethodsAccording to the standard for the biological evaluation of the medical devices,the acute toxicity test,sensitization test,skin stimulating test,cellular toxicity test,and genotoxicity test were carried out to evaluate the biocompatibility of the prepared implants.ResultsNo animal died and no toxicity symptom or adverse effects were shown within 72 hours. No obvious sensitivity were observed.Skin stimulating reactions were not found in the experimental groups and negative control group by intradermal stimulation test. The toxicity of materials leaching liquor was graded from 0 to 1,which means the material has no cytotoxicity.Ames test,chromosome aberration test,and micronucleus test of bone marrow cells in mice were negative and lacked toxicity.ConclusionThe new xenogenic tendon matrix material has good biocompatibility,and it may be served as a promising implant material.
Key words:xenogeneic material;biocompatibility
临床上因各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形修复外科面对的主要问题，而材料充填是畸形缺损修复的重要手段之一。目前临床常用的材料如固体硅橡胶、膨体聚四氟乙烯都不同程度存在一些问题而不能完全满足临床治疗的要求。来源于动物组织的天然生物材料，其结构与人体组织相似，是制造人工组织、器官的理想材料之一。前期我们以动物(猪)肌腱为原料，应用组织固定、去抗原等系列专利技术，研制出了异种肌腱基质材料，并对其理化性能进行了初步检测，证实该材料具有良好的理化性能[1]。在此基础上，我们拟通过体外试验评价该材料的生物相容性，研究评价其作为组织修复材料的生物安全性。以期获得理想的组织填充物，为今后的研究及临床应用提供依据，现报道如下。
1材料和方法
1.1 试验动物、主要试剂及材料：健康6周龄昆明小鼠 60 只，雌雄不限，体重18～22g；成年新西兰白兔3 只，雌雄不限，体重2.5～3.0kg；白化豚鼠30只, 雌雄不限，体重300～500g。以上实验动物均由南方医科大学实验动物中心提供。四甲基偶氮唑盐（MTT）及二甲基亚砜( DMSO)（上海碧云天公司）,小鼠成纤维细胞( NCTC L929，中山大学医学院细胞库)，DMEM( Hyclone公司，美国)，小牛血清( Gibco公司，美国)。鼠伤寒沙门氏菌TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102,中国仓鼠肺成纤维细胞，丝裂霉素-C、秋水仙素、环磷酰胺（中国药品生物制品检定所）。
异种肌腱基质材料由再生型医用植入器械国家工程实验室研制并提供，取新鲜猪肌腱，进行以下脱细胞处理: ①应用高反应活性环氧化物作动物组织的交联固定剂,进行胶原交联固定；②应用化学方法,封闭免疫基团和特殊位置的基团,改变胶原、多肽的特异构象；③应用复合酶(胰蛋白酶等)、表面活性剂(曲拉通等)化学方法脱细胞。经上述处理后的材料经裁剪后钴60 照射灭菌，备用。
1.2 材料浸提液的制备：使用极性溶剂生理盐水作为浸提介质。将钴60照射灭菌的材料按样品质量与浸提液体积比为 0.2g/cm2，使材料全部浸入其中，在 37℃ 无菌条件下浸提 72h 作为材料的浸提液。
1.3 急性全身毒性试验：昆明种小鼠10只，随机分为2组，每组5只，雌雄分笼喂养，各组小鼠标记编号，称重并记录。每只小鼠从腹腔内按50ml/kg 剂量，实验组注射材料浸提液，对照组注射生理盐水。注射后1、2、3、7天 观察各组小鼠的一般状态、毒性表现及死亡动物数。7 天后处死小鼠，观察小鼠腹腔有无粘连，各组取两只动物肝、肾、脾行组织学检查，记录注射部位出现的其他异常情况。
1.4 致敏试验：健康初成年的白化豚鼠30只, 雌雄不限，体重 300～500g。采用最大剂量法。先用材料浸出液 0.1 ml 进行注射诱导, 注射区用上述实验液贴附,然后进行激发。阳性对照采用5% 甲醛溶液, 用生理盐水作为阴性对照。
1.5 皮内刺激实验：取新西兰白兔3只，每只动物脊柱左侧5个点注射生理盐水各0.2 ml作为空白对照，每点间隔0.2cm，右侧5个点注射材料浸提液各0.2ml，注射后24、48和72 h观察记录各注射部位状况。按皮肤反应评分系统对每个注射部位的红斑和水肿组织反应进行评分，计算局部原发刺激指数（primarily stimulation index，PII）。
1.6 体外急性细胞毒性试验
1.6.1培养基浸提液制备：浸提介质为含10% 小牛血清的DMEM 细胞培养液，然后按样品质量与浸提液体积比为 0.2g/cm2，在37℃无菌条件下浸提72h作为材料浸提液。
1.6.2 细胞培养及分组：采用96孔培养板,各组均加入 5×103/ml L929 小鼠成纤维细胞悬液 200μl,37℃、5% CO2 培养箱孵育,待细胞贴壁后，分别按照以下分组定期更换培养液(100μl/次) :①阴性对照组( n=8),正常培养液；②实验组 (n=8)，10% FBS+DMEM 与材料浸提原液各 50% ；③阳性对照组(n=8)，含0.64%苯酚的10% FBS+DMEM；每组材料8个平行样，置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h。
1.6.3MTT 法检测细胞活性：分别于培养 24h、48h 和 72h 取 出 1 个 96 孔 板，按照 20μl/孔、加入 5 mg/ml MTT,37 ℃、5%CO2下培养 4 h； 吸出培养液, 再加入DMSO( 150 μl/孔),室温下振荡至结晶物溶解,在酶标检测仪上( BIO-RAD Mode 680,波长为 570nm) 测定吸光度( OD 值),计算细胞增殖率(RGR)=(实验组 OD 值/阴性对照 OD 值)×100%。细胞毒性判断标准[1]：0 级为≥100%，1 级为75%～99%，2级为50%～74%，3 级为25%～49%，4级为1%～24%，5 级为0。
1.7 遗传毒性试验
1.7.1 Ames试验：所用菌株为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102, 采用标准平板渗入法, 在加和不加代谢活化系统(S9) 条件下进行材料浸出液按3 cm2/ml 双面表面积之和的比例用生理盐水配置。70℃条件下, 持续24 h, 过滤后备用。样品的5 种浓度各作 3 个平行样,计数各皿菌落数。生理盐水注射液为阴性对照。阳性对照采用9-氨基吖啶、叠氮钠、2, 7-二氨基芴、2-二氯基芴。
1.7.2 染色体畸变试验：细胞株为中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)。以DMSO作为阴性对照。阳性对照采用丝裂霉素-C、秋水仙素、环磷酰胺。
1.7.3微核试验：昆明种小鼠50 只, 6～8 周龄, 体重25～30g, 雌雄不限。用实验材料的浸取液(分低、中、高3 个剂量组) , 喂食实验小鼠,阳性对照组每天经口给予环磷酸胺 40mg/kg。取股骨,挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀, 常规涂片, 涂片自然干燥后放入甲醇中固定10 min, 将固定好的涂片放入Giemsa 染液染色10～15min。用pH 6～8 磷酸缓冲液反复冲洗，再用蒸馏水冲洗后晾干，油镜下观察。每组观察1 000 个嗜多染红细胞, 观察嗜多染红细胞的微核, 记录微核细胞数。
1.8 统计学分析：采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，试验组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法，P0.05)，且各剂量组畸变率均0.05),阳性对照组与阴性对照组相比有统计学意义(P 对生物材料的生物相容性评价方法主要有两类, 一是动物体内实验, 即将材料植入体内, 分阶段将植入材料与周围组织取出, 作组织学检查, 观察材料及周围组织病理变化, 评价组织相容性；另一类为体外实验, 即用材料或材料浸提液研究材料对组织细胞生长、代谢及增殖方面的影响。Johson等(1977)认为在区别生物材料的毒性及对细胞影响方面, 体外实验较体内植入更敏感。国内外先后制定了多种标准, 我们主要参考ISO有关生物材料和医疗器材生物学评价技术要求[7-8],选择相关的体外实验对材料进行生物相容性和安全性评价。
按照GB/T16886.1对外科植入器械的分类[9],本研究制备的异种肌腱基质材料属于体内长期植入材料，选用急性毒性试验、致敏试验、皮内刺激实验、细胞毒性试验和遗传毒性试验属于基本评价范畴, 符合《医疗器械生物学评价和审查指南》提出的要求[10],基本可以满足对异种肌腱基质材料的生物学评价要求。
从检测结果看，急性毒性实验：各组小鼠活动正常，72h 小鼠无死亡，各组动物未见中毒症状或不良反应。致敏试验显示材料组和阴性对照组的皮肤反应指数均为0,无致敏性。皮内刺激实验观察显示，材料浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死，极轻微刺激。材料的细胞毒性结果示该材料的相对增殖度较高，细胞毒性分级在0-1级。遗传毒性试验指标均达到标准要求，无遗传毒性。故该材料在急性毒性试验、致敏试验、皮内刺激实验、细胞毒性试验及遗传毒性试验检测指标均达到测试要求，证明制备的异种充填材料具有良好的生物相容性，能够满足生物材料的应用要求。
综上所述, 本研究应用专利技术研制的异种肌腱基质材料具有良好的生物相容性和生物安全性,最大程度的去除了动物肌腱异种蛋白的免疫原性，作为一种组织充填材料具有一定的应用前景，但其体内生物安全性及长期转归尚有待进一步的动物实验研究。
[参考文献]
[1]夏学颖,姜平,张伟,等. 新型异种充填材料的制备及性能检测[J].南方医科大学学报,2010,30(5):1156-1159.
[2]Schmidt CE, Baier JM. Acellular vascular tissues: Natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J].Biomaterials,2000,21(22): 2215-2231.
[3]Park SN, Park JC, Kim HO, et al. Characterization of porous collagen?h yaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl )carbodiimide cross-linking[J].Biomaterials,2002,23(4):1205-1212.
[4]Zhu Y,Chian KS,Chan- Park MB, et al. Protein bonding on biodegradable poly (L-lactide-co-caprolactone) membrane for esophageal tissue engineering[J].Biomaterials,2006,27(1):68-78.
[5]漆松涛,张文清,冯文峰,等. 带生物膜跨血管包裹性动脉瘤夹的研制与应用[J].生物医学工程学杂志,2008,25(3):699-702.
[6]邓美海,方和平,胡啷,等.生物型补片与聚丙烯补片修补家猪腹壁缺损的对比研究[J].中华普通外科学文献（电子版）.2008,2(5):367-370.
[7]International Organization for Standardization. Biological evaluation of medical devices-Part 12: sample preparation and reference materials (ISO: 10993212: 1996). Geneva: ISO, 1996.
[8]International Organization for Standardization. Biological evaluation of medical devices-Part 5: tests for in vitro cytotoxicity (ISO:1099325:1999). Geneva: ISO,1999.
[9]国家质量监督检验检疫总局.中华人民共和国国家标准: 医疗器械生物学评价第1部分: 评价与试验(GB/T 16886.1-2001,ISO10993-1:1997)[S] . 北京: 中国标准出版社, 2002: 3-6.
[10]国家食品与药品监督管理局. 医疗器械生物学评价和审查指南[ EB/OL]. 2007-6-15/ [2007-11-12]. http://www.sda.省略/WS01/ CL0055/10708.html
[收稿日期]2010-12-08[修回日期]2011-03-15
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”