血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前最强有力的血管生成因子[1],能增加微静脉、小静脉的通透性,促进血管内皮细胞分裂与增殖,使细胞质钙聚集,诱导血管生成,在胚胎发育、创伤愈合、肿瘤生长与转移过程中起重要作用,因此VEGF的血管化作用是机体生理及病理性组织生长和损伤愈合的基础。本文就VEGF基因治疗在血管化方面的作用进展作一综述,为进一步研究VEGF基因治疗与血管化作用提供理论基础。
1VEGF及其受体
1989年,Connolly等[2]从正常垂体滤泡细胞中分离出了一种能选择性促进血管内皮细胞形成的蛋白质,称之为血管内皮细胞生长因子(VEGF)。VEGF是一个分子量为45000,能与肝素结合的二聚体糖基化的碱性蛋白,它在多种细胞与血管生成相关的进程中表达。人的VEGF基因位于染色体的6p21,由8个外显子及7个内含子构成,基因全长28kb,编码基因长14kb,分子量约34～45kD[3],编码产物为同源二聚体糖蛋白,等电点为8.5,有很强的耐热和耐酸能力。目前已发现的VEGF家族包括七个成员即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF(Placeta Growth Factor,胎盘生长因子)[4]。VEGF-A发现最早,故多数文献中的VEGF即指VEGF-A,在组织和细胞中含量最丰富,功能最强,是以二硫键相连的寡二聚体糖蛋白,分子量为35～45KD,经过不同的剪切方式可以7种不同的亚型出现,分别是VEGFl21、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206,VEGF165为最主要的同分异构体[5]。
血管内皮细胞生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)是VEGF特异性的膜受体,具有高亲和力,属于酪氨酸激酶亚家族中的一个新成员。作为一种典型跨膜镶嵌蛋白,分为胞外区、跨膜区及膜内区三部分,以胞外7个免疫球蛋白样的超二级结构、胞内两个间开的酪氨酸激酶区为其特征。目前已知VEGF家族有三个受体:VEGFR-l、VEGFR-2、VEGFR-3,分别由fit-1、flk-1-KDR、fit-4基因编码[6],其中VEGFR-2即KDR主要参与血管形成过程[7]。
2VEGF促血管化作用
VEGF最主要的生物学作用是通过和血管内皮细胞的特异性受体结合,从而促进动脉、静脉以及淋巴管来源的内皮细胞生长[8],其他血管生成因子的作用大多是通过增强VEGF的表达而间接实现。自身内源性的VEGF是机体组织损伤恢复重要的血管生长因子,Akira[9]通过实验证实肌肉损伤后的早期VEGF及其受体的mRNA表达明显增高,与损伤早期的血管化程度密切相关,从而也间接说明了VEGF的重要血管化作用。治疗性血管生长是针对治疗缺血性血管疾病的一个新概念,它包括诱导血管发生、小动脉生成及淋巴管生成[10]。在血管生长中,VEGF调节内皮细胞外基质溶解、内皮细胞迁移、增生和管腔形成。VEGF在多种在体模型中强烈地促血管生成作用已经被多个实验证实[11]。
3VEGF基因治疗途径的发展
VEGF的半衰期很短,仅为数小时甚至更短,Shima等[12]认为VEGF165的生物半衰期在正常氧分压下是30～45min,在低氧下是6～8h。由于VEGF生物半衰期短,注入体内易稀释,故外源给予VEGF蛋白质进行治疗效力有限,为克服单纯蛋白质治疗的缺点,人们考虑应用VEGF基因治疗,即将外源VEGF基因导入目的细胞并有效表达,从而达到治疗目的。近20年来,VEGF基因治疗方法得到了不断发展。基因治疗需要合适的载体,目前被研究应用最多的是腺病毒载体,有实验证实重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、转染效率高、体外转染安全[13]。实践中遇到的问题是导入的基因难以在体内持续表达,有些难以获得有效基因转移,体外细胞增殖困难,自体细胞来源少及再移植后存活率低等。于是,Sun[14]和Chang等[15]提出了异体细胞基因治疗的策略,即将目的基因导入已建立的细胞系内,使其表达基因产物,再将其移入患者体内。这种方法虽然扩展了细胞来源,但是免疫排斥反应又限制了其应用,同时为了增加重组基因工程细胞数量,多采用具有高分裂活性的细胞株,易形成肿瘤。随着微囊化技术的出现,人们尝试应用该技术,将重组基因细胞用微囊包裹后进行移植,以此外源基因为模板,转基因细胞为加工厂,在体内编码生产治疗性蛋白[16-17]。微囊化技术既克服了免疫排斥反应,又限制了邻近细胞过度增殖,使同种异体移植成为可能,微囊化VEGF基因修饰细胞移植可为VEGF治疗性血管化提供新的思路和途径[18]。
此外,联合应用其他血管生长因子进行基因治疗也是VEGF基因治疗的一个方向。Lei等[19]应用一新的含VEGF165和血管生成素-1(angiopoietin-1)腺病毒双顺反子载体,经人骨骼肌成肌细胞递送,注射到猪心肌梗塞模型的心肌内,结果显示在猪心脏产生了更大比例的具有功能的成熟血管,增强了血管化作用。
4VEGF基因治疗在血管化作用方面的应用现状
4.1 对缺血性疾病的治疗作用:VEGF能改善缺血性肢体的循环状态,Shimpo等[20]利用大鼠缺血性肢体模型,采用腺病毒相关病毒(AAV)介导的VEGF转染可促进毛细血管增生,增加肢体的血流量。在治疗心血管疾病方面,Rutanen等[21]通过实验证实,VEGF基因转染明显增强了心脏室壁血管形成,改善了心肌的灌注。前体促血管形成因子基因治疗难愈症状性冠状动脉疾病和周围血管疾病的患者,可促进新生血管生长[22]。VEGF基因治疗可促进皮瓣成活,O"Toole等[23]将VEGF165 cDNA表达质粒注入缺血性大鼠的腹壁皮瓣下,结果表明VEGF治疗组较对照组皮瓣成活面积大。目前已经发展到联合应用细胞治疗和VEGF基因治疗,已证实可有效增强不同的动物模型血管化[24]。
4.2 在创面愈合方面的作用:损伤组织的再血管化是创面愈合的重要组成环节。Galeano等[25]将小鼠造成Ⅱ度烫伤,在创面边缘注射含目的基因VEGF165的重组AAV14天后检测,治疗组创面VEGF表达水平明显高于对照组,内皮细胞增生、血管形成及细胞外基质的成熟情况等都优于对照组。另外,对于一些缺血性、慢性难愈创面,如糖尿病合并慢性溃疡等,VEGF基因治疗显示了潜在的应用前景[26]。Yoon等[27]应用超声介导的小环VEGF165 DNA基因治疗糖尿病鼠皮肤创面是有效的。
4.3 对肿瘤方面的应用:VEGF在肿瘤的发生、发展及转移中起到了很大作用,因而VEGF基因治疗可应用于肿瘤防治,目前主要是采用反义寡核苷酸或反义RNA技术,在基因水平或翻译水平抑制VEGF的表达,从而达到抗肿瘤血管生成的目的。Buchler等[28]应用反义VEGFR基因治疗胰腺癌发现,反义VEGFR-2基因可明显抑制VEGF诱导的肿瘤细胞的过度生长。
4.4对移植组织的血管化作用:通过基因转染使VEGF超量表达,可能成为提高移植皮肤替代物成活率的一条新途径。在促进皮肤移植物血管化方面,韩焱福等[29]通过腺病毒介导的VEGF基因转染NIH3T3细胞,结果显示体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生。Paolo等[30]通过实验研究显示,能表达VEGF的重组肌肉细胞与肌肉组织同时移植,可显著增加新生血管和肌肉的体积。
5问题及展望
5.1 VEGF基因治疗生成的血管是否稳定:对于缺血性心肌及肢体缺血等疾病,足够而稳定的新生血管对于治疗结果很关键。VEGF重组腺病毒表达时间短暂,约4～5周,虽然这段时间足以诱导新生血管的形成,但尚不知在血管生成因子的生成停止以后,这些新生血管是否持续存在。另外,体内VEGF受到许多细胞因子的调控,包括上调和下调,如IL-1a、IL-1b、bFGF、IL-4、IL-10、IFN-γ等[31-32]。
5.2 VEGF基因治疗的安全性:从理论上讲,转基因治疗后VEGF的表达有可能促进现阶段未被发现的小肿瘤生长。但迄今在应用VEGF进行基因治疗的患者中,还未见发生危险的相关报道。VEGF还有一些常见的副作用,如VEGF诱导NO释放,引起短暂性低血压;VEGF增加血管通透性,导致周围性水肿;VEGF的应用可能会促进病理性血管生成,引发或加速病变发展。因此,关于VEGF基因治疗的远期安全性还需要进一步研究和观察。
5.3 展望:促进VEGF高表达的基因治疗,在缺血性疾病等方面已显示出一定的效果。由于血管生成在组织再生和损伤修复中的重要作用,应用VEGF基因治疗在促进组织再生、伤口愈合及加速移植物特别是组织工程器官血管化等方面可望有良好的应用前景。VEGF基因治疗的途径也在不断地改进,如超声介导的VEGF质粒微泡可靶向性地转染内皮细胞,可改善严重慢性缺血组织的灌流,被证明是一种很有前景的无创技术[33]。而微囊化转VEGF基因细胞移植作为一种新的生物投递技术,也将在组织移植血管化与创面修复方面发挥积极的作用[34]。目前这方面的研究还在探索中,必须进一步考察微囊在体内的长期转归,囊内细胞生存以及探究最佳移植方法。
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[收稿日期]2009-12-14 [修回日期]2010-01-27
编辑/李阳利